研究证实,非洲猪瘟病毒可以通过饮水和饲料传播!

2019-02-25 23:35:43 111

摘要

非洲猪瘟是一种具有传染性,快速传播的跨国界动物疾病,并主要威胁全球的生猪养殖企业。所有在饲料厂生产的饲料,都被认为有潜在的将该病毒传播到猪场的风险,但是非洲猪瘟病毒在饲料中传播的风险研究报道非常的少。本文的目的是为了研究ASFV格鲁吉亚2007株在通过自然饮水和摄食饲料的过程中,感染猪只所需要的最低和中等剂量病毒。非洲猪瘟病毒在饮水中的最低感染剂量为100 50%TCID50。在饲料中为104 TCID50。中等感染剂量在水中为101 TCID50,在饲料中为106.8 TCID50

我们的研究报道证实ASFV格鲁吉亚2007株可以通过口腔传播,尽管在饲料厂生产的饲料中感染剂量相对要求较高,这些数据可以为研究非洲猪瘟传播的风险模型提供非常重要的信息。非洲猪瘟病毒是对于北美和欧洲生猪养殖企业的一个新威胁,在过去的20年里,非洲猪瘟病毒传播到了东欧和俄罗斯,近年来传播进入中国和比利时。非洲猪瘟感染后的特征是严重的全身性出血,并且报道得案例死亡率可以达到百分之百。该病毒属于非洲猪瘟属,并且是唯一已知的虫媒性的DNA病毒。

非洲猪瘟疾病控制的难点在于缺乏有效的疫苗,并且该病有可能在野猪和蜱之间地方性的流行。由于缺乏有效的疫苗以及治疗方法,在ASF阴性国家里,预防非洲猪瘟的传入成为首要任务。非洲猪瘟发生之后,对周边的猪只采用限制流动以及大规模扑杀感染猪只的策略。据估计,如果非洲猪瘟传播进入美国,损失将会大于40亿美元。

在历史事件上,包括2007年非洲猪瘟进入高加索地区,以及之后传入俄罗斯地区,都被证实是通过食用被污染的猪肉制品,或者直接与猪只接触造成的。在肉和血液中存在的非洲猪瘟病毒在室温下可以存在数月以上,并且对于温度和pH值有一定的抵抗力。分子研究显示,近来中国和西伯利亚发生的非洲猪瘟病毒,在基因型上都与格鲁吉亚2007株类似。这些报道的案例,猪群之间都相隔上千公里以外,例如,非洲猪瘟从沈阳到温州,至上海,在三周之内传播了将近2100km。最近罗马尼亚也有报道,非洲猪瘟在大型生物安全等级较高的猪场内发生。非洲猪瘟病毒是经由附近污染的河流进入该14万头种猪厂的。2013年美国发生的流行性腹泻,被证实是病毒经由污染的饲料,通过饲料运输车跨界将该病毒运送到了生物安全等级较高的大型猪场之内,这也被认为是一个非常高的风险。从猪流行性腹泻跨境传播的案例中,我们认识到饲料在传播疾病过程中扮演的风险角色。但是数据显示非洲猪瘟通过饲料传播的风险是有限的。

2014年非洲猪瘟进入拉脱维亚境内并且在该地区传播,被发现伴随着将病毒污染的新鲜草料喂给阴性猪只的行为。除此之外,近来的研究报道证实,非洲猪瘟病毒可以在饲料原料中存活,例如传统豆粕、有机豆粕、豆油,豆饼、胆碱等,并且通过跨太平洋航运从东欧运送往美国。这些报道提示非洲猪瘟的传播也有可能通过运输途径,例如饲料或者饮水的途径传播,但是这些被人们所知甚少。非洲猪瘟主要通过几个途径传播,包括肌肉注射传播,口鼻传播以及直接接触传播。在很多研究口鼻传播途径的实验中,非洲猪瘟病毒是直接注入口内或者扁桃体上。非洲猪瘟通过生产的饲料或者自然饮水过程感染所需要的感染剂量研究报道是缺失的。此外也没有格鲁吉亚2007株通过饲料传播的研究报道。尽管有田间报道经过饲料传播的案例,但是并没有报道关于成功感染的剂量。因此我们的研究目标是:第一,确定感染成功和剂量之间的关系;第二,确定非洲猪瘟成功使一头猪感染的最小或者最低剂量(MID);第三,当猪只自由采食或者饮水时,确定能够使半数猪只感染非洲猪瘟格鲁吉亚2007株的半数感染量(ID50)。



材料和方法


非洲猪瘟病毒接种准备

我们分离并使用非洲猪瘟格鲁吉亚2007株作为本次实验研究的材料。病毒从感染的猪只脾脏内收集,将脾脏研磨后,使用添加青霉素和两性霉素B的PBS处理细胞,将材料于4000转离心30分钟,并于4℃保存。将材料用添加青霉素和两性霉素B的PBS再次悬浊,并且反复冻融三次获得病毒,将悬浊液离心后取上清于4℃保存。取3到5周龄大小的猪的肺泡巨噬细胞作为病毒滴定的材料,使用添加10%胎牛血清RPMI培养基培养肺泡巨噬细胞,于37℃ 5% CO2的孵化箱内孵育2天。将病毒按10的倍数进行倍比稀释,并且加入培养有肺泡巨噬细胞的96孔板中,37℃下培养3天,之后用80%的丙酮固定细胞十分钟,将p30单克隆抗体稀释1:6000后用于细胞染色,37℃孵育1小时,并且用PBS清洗3次,使用羊抗鼠抗体按1:400倍稀释,检测结合的抗体,37℃孵育1小时,使用荧光显微镜观察染色的细胞,并且计算每毫升log1050%组织感染量 (TCID50/mL)。最终我们从脾脏中分离出格鲁吉亚2007株,病毒含量从100 TCID50 到 108 TCID50,添加到每100mlRPMI培养基或者100g饲料中。饲料的基本配料是玉米和大豆,并且根据营养配方添加足够的营养物质,适合用于10-25kg仔猪,不含动物源性原料。将每10ml病毒加入100g饲料中,停留30s,然后手动拌匀。

动物饲养

本实验使用的猪只和病毒都严格按照美国农业部动福利实施和动物福利法规关于研究和教学中关爱和使用动物的动物科学社会联邦指导原则进行。研究通过肯萨斯州立大学动物关爱和使用协会和生物安全委员会批准。

使用84头猪(平均51.8 + 2.2天),来源于同一种源。猪只分别存放于3个P3实验室的房间内。室内环境可控,每个房间每小时换气14.5次,每只猪单独一栏,每栏之间相隔1.5m以上。每栏三面为坚实的墙面,第四面有门。采用预防空气传播的措施,房间内设有对照阴性组,以观察栏舍之间是否有交叉污染的现象。


实验设计


水和饲料实验均设有7个组,每个组分别有6只猪进行饮水实验和6只猪进行饲料实验。在每组中给5只猪一定剂量的ASFV,另外1只作为阴性对照。为了确定ID50,我们根据相关文献研究将水103 TCID50 和饲料104 TCID50 设为初始感染剂量,然后在完成一组的实验后,根据实验结果对第二组的剂量进行调整。最后实验的剂量和分组如下表。

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每天对猪只进行两次临床评估,观察有无ASF临床症状,并且在接种后0天和第5天采血。在接种后5天内出现临床症状的猪将被安乐死,采集血样和组织。存活的猪只在接种后第5天全部安乐死,并且进行剖检。采用RT-PCR检测猪脾脏和血样中的ASFV,并且对脾脏进行病毒分离。做出剂量-反应曲线并且计算ID50


数据分析


本实验采用3种检测方法(PCR检测脾脏,PCR检测血清,以及脾脏病毒分离),每只猪会有一个3维结果。只要任何一个检测结果为阳性,ASFV感染视为阳性。我们使用约束性样条回归分析来分析剂量和感染率的关系。约束性被限定为剂量升高时感染率也会升高,并且这样的关系是持续的。根据三种检测的结果,我们在贝叶斯分层模型内使用约束性样条回归以估算每个剂量的病毒在一次暴露下的感染概率。在单次暴露的基础上,我们也模拟了重复暴露的高结果,假设重复暴露都是独立事件。因此,我们统计多次暴露的感染率为1 – (1 – p)q,p是单次暴露后感染的概率,q是暴露的次数。


结果



感染结果见下图。实验猪共64只,另外14只阴性猪只中,未检测到ASFV。

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因此可见实验过程中保证了足够的生物安全。在饲料实验中,32只猪只感染,其中16只(50%)猪通过病毒分离和PCR检测肾脏为阳性,8只猪(25%)仅病毒分离阳性,8只猪(25%)3检测均为阳性。

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图1 A为1次暴露 B为3次暴露 C为10次暴露

总体来说,在饲料和水中,ASFV的感染可能性随着剂量增加而升高。在水中,引起至少1只猪感染的最低感染剂量(MID)为100 TCID50,饲料中最低感染剂量(MID)的剂量达到104 TCID50。对于一次暴露,饮水接触具有更高的感染可能性,在107.5 TCID50时95%猪只可以被感染(见图1A)。在饮水最高剂量实验检测中(104TCID50),100%猪只感染ASFV。与其相比,在本实验中没有饲料的剂量可以达到100%感染率。

当考虑多次暴露时,饮水和饲料在各个剂量水平的感染率都会增加(图1B和C)。通过饮水暴露10次后,最低剂量1 TCID50 ASFV的感染可能性接近1.对于饲料中多次暴露,其95%CI在最低剂量时范围变大,提示在多次暴露时感染率的不确定性增高。

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图2

该结果是由于少量的猪只在一次性暴露后被感染,接触到低剂量病毒并且感染率较低。病毒的半数感染剂量分布见图2。 饮水的ID50是101.0 (95% CI 100–102.3),饲料的ID50是106.8 (95% CI 104.6–108+)。



讨论



本实验证明ASFV可以有效的通过饮水和饲料经口传播。早期研究表明ASFV KWH/12株通过乳汁传播的最小50%血细胞吸附率是105之后,Howey等人测定了3倍剂量的ASFV Malawi 1983株经口腔灌服对商业猪的感染力。尽管102HAD50的低剂量并未引起感染(0/2),但中等(104 HAD50)和高(106HAD50)剂量足以在100%的猪(4/4)(35)中引起感染。最近,一项研究表明,与ASFV格鲁吉亚2007株相关的分离株,即使是较低剂量的也能诱导感染。具体来说,Pietschmann等人表明, 使用ASFV亚美尼亚2008株,低至3和25血吸收单位的病毒口鼻剂量,使用2毫升脾悬浮液接种导致了野猪感染。在虚弱和体况较差的野猪身上,表现出更高的易感性。

在我们的研究中,我们通过口服液体确认了ASFV格鲁吉亚2007株的高传染性。值得注意的是,我们实验中能够主动饮用被污染的液体猪是健康和健壮的。生产性感染导致将近40%的猪暴露在含有1TCID50的ASFV液体接种物中。自然饮水中含有ASFV低感染剂量应被视为ASF通过水传播的一个可能因素,这与多瑙河与罗马尼亚ASF传播的流行病学证据一致。

通过口鼻或眼内液体接触途径接种的ASFV可能会因病毒暴露于鼻咽部(包括扁桃体)或胃肠道而导致感染。由于ASFV在广泛的pH值范围内(从4到10)具有很高的稳定性,因此理论上可能在酸性胃环境中存活,但通常不太可能。更可能的是,液体介质为病毒与扁桃体接触提供了理想的媒介,在自然暴露于ASFV后,病毒在扁桃体复制。

有报道发现猪只感染ASFV的途径包括摄入含有感染动物组织的饲料。早在1954年,有报道称,通过口服摄入传播ASFV所需的最小剂量为105。Plowright等人用含103.7–106.1 HAD50 ASFV的猪匀浆组织感染猪只实验失败。相反,Colgrove等人将50克感染猪的脾脏和肝脏粉碎物加入固体饲料中,成功感染家猪。每克组织中含有107.0–107.5HAD50的ASFV分离白细胞II。我们的实验研究使用了ASFV格鲁吉亚2007株表明,通过食用饲料成功感染ASFV的剂量需要比液体更高。与液体相比,饲料可能刺激唾液蛋白酶降解病毒。此外,饲料物质可能抑制扁桃体接触,减少病毒在进入胃肠道前暴露给淋巴组织和上皮组织。

尽管在本研究中观察到饲料中的MID值高于液体,但我们推测与现代养猪生产系统中的水源相比,饲料实际上可能具有更高的风险。饲料输送是一个高频率的事件,饲料生产高度集中;因此,受污染的饲料很容易分散到大量养猪场。与我们的研究相比,猪也可能以更大的体积(>100 g)和更高的频率(>1次接触)食用受污染的饲料。使用ASFV污染的完整饲料后给予3或10次暴露,生产性感染的可能性显著增加(图1,B、C组)。因此,尽管与液体相比,在受污染饲料中摄入ASFV后感染的概率较低,但高暴露频率可能使饲料成为更重要的传播风险因素。更大的风险是高度集中化的饲料厂使用来自全球分销供应链的原料。例如,美国中西部一家养猪场的库存表明拥有来自北美、亚洲和欧洲12个国家的饲料成分。

截至2019年2月,ASFV已扩散到罗马尼亚的一个高生物安全农场,并在中国25个省(包括首都北京)的猪群中检测到,受影响的猪群之间相隔数千公里。在世界上最大的猪肉生产国,ASFV是如何跨越如此广阔的区域传播还不得而知;然而,应该考虑在饲料或饲料成分中病毒的移动的可能性。我们的研究结果表明,ASFV可以通过液体和饲料经口传播,支持了饲料病毒传播过程中的潜在作用。

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